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山葡萄北冰红VvCOR413—I1基因克隆及生物信息学分析

作者:admin 更新时间:2018年07月22日 17:04:53

  摘要[目的]从山葡萄北冰红中克隆耐寒基因COR413,并对其功能进行生物信息学分析。[方法]利用RT-PCR法克隆山葡萄北冰红基因COR413,并利用生物信息学对其进行分析。[结果]它包括630bp完整的开放阅读框,推测编码210个氨基酸,蛋白的分子量(MW)为59.18kD,等电点(pI)值为10.74。其蛋白结构以α-螺旋、延伸链为主,其次为无规则卷曲,β-转角所占比例最少,含有4个跨膜结构域。多重序列比对表明VvCOR413-I1与其他植物COR413的氨基酸序列相似性为63.00%~68.33%。[结论]该研究为深入了解VvCOR413-I1功能奠定了基础。


  溫度胁迫是重要的非生物胁迫因子之一,其对植物的生长发育、花期、果期等产生重要的影响。植物接受不利温度的逆境信号后,通过信号传导途径,调节细胞内胁迫蛋白的表达。冷适应蛋白(coldregulated,COR413)基因作为植物特有的一类低温胁迫响应功能基因,在抗寒过程中发挥重要作用。冷驯化拟南芥转录组研究表明,COR413基因受低温调控,被称为低温诱导基因[1-2]。在植物COR413基因中含有CRT元件,CRT元件与CBF相互结合后引起COR413的表达,但是CBF的调控受到ICE的调控,ICE是一种组成型表达的蛋白质,但是蛋白质的泛素化是通过磷酸化来进行识别和调控的[3-4]。植物耐寒COR413已在多种植物中被克隆出来,并进行了功能验证。植物耐寒分子机制是一个复杂的过程,由多个基因协同作用在耐寒信号通路以抵御冷害,但有报道表明,单转COR413基因也能提高植株的耐寒性,如罂粟、菠菜、播娘篙等[5-7]。笔者以山葡萄北冰红为材料,利用RT-PCR扩增技术,获取其耐寒基因VvCOR413-I1,并进行生物信息学分析,为研究其功能和耐寒分子育种奠定基础。


  1材料与方法


  1.1材料取山葡萄北冰红新鲜叶片为供试材料。ExTaqDNA聚合酶、克隆载体PMD18-T、胶回收试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司,感受态细胞JM109保存于内蒙古民族大学植物生物技术实训室,其他试剂均为国产分析纯。


  1.2方法


  1.2.1山葡萄北冰红总RNA的提取及引物设计。使用Trizol提取法提取总RNA,几乎没有DNA和蛋白质污染,其纯度较高,具有较好的效果。根据葡萄基因组(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)设计特异性上下游引物,并命名为VvCOR413-I1-F和VvCOR413-I1-R(表1)。


  1.2.2VvCOR413-I1全长cDNA的克隆。叶片总RNA提取及cDNA第一链合成严格按照试剂盒说明书进行操作。以cDNA为模板,利用Ex-TaqBuffer,Ex-Taq,dNTPMixture(2.5mmol/Leach)和引物VvCOR413-I1-F、VvCOR413-I1-R扩增VvCOR413-I1全长。反应条件:94℃5min;94℃30s,55℃40s,72℃90s,30个循环;72℃10min。反应产物通过1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,在凝胶成像系统下观察分析并拍照。PCR产物用北京索莱宝科技有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化,克隆载体选用pMD18-TVector,从-20℃冰箱中取出目的片段,在冰盒上融化后与克隆载体连接,反应条件:16℃9h。取200μL大肠杆菌感受态细胞与10μL重组质粒于同一试管中,用移液器轻轻混匀,将离心管至于冰水浴中30min,42℃温水浴90s,冰水浴5min,37℃温水浴5min,然后加入800μL液体LB培养基,在200r/min的条件下,保持37℃不断摇菌2~3h。将菌落PCR(反应体系和条件同VvCOR基因克隆)和酶切验证正确的阳性克隆送至北京华大基因测序。


  1.2.3VvCOR413-I1生物信息学分析。对测序结果进行分析,确定克隆获得VvCOR413-I1基因cDNA序列完整开放阅读框。利用TMHMM、SOPMA、NetPhos3.1Server等生物学软件进行生物信息学分析。


  2结果与分析


  2.1山葡萄北冰红叶片总RNA活性的检测将提取好的总RNA用DEPC水进行10倍稀释,然后通过琼脂糖凝胶电泳(图1),并检测其纯度OD260/OD280=2.10,其纯度较好,可满足下一步试验要求。


  2.2VvCOR413-I1克隆


  采用RT-PCR法克隆葡萄VvCOR413-I1,利用设计的全长特异性引物,扩增得其cDNA全长633bp(图2)。


  2.3VvCOR413-I1鉴定


  挑取阳性菌进行PCR鉴定,同时提取阳性菌的质粒,进行双酶切,结果见图3、4。从图3、4可看出,菌液PCR和双酶切电泳结果显示条带都为650bp左右,与克隆结果一致,推断VvCOR413-I1成功导入大肠杆菌感受态中,并与克隆载体构建成功。


  2.4葡萄VvCOR基因生物信息学分析


  2.4.1VvCOR413-I1序列分析。利用DNAMAN软件对获得的VvCOR413-I1全长序列进行分析,包括630bp完整的开放阅读框,可推测编码210个氨基酸的多肽,分子量为59.18kD,等电点(pI)值为10.74,pH=7.0时电荷为13.05。利用NCBI的ConservedDomains(http://www.ncbi.Nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb/cgi)预测基因保守区,结果表明VvCOR413-I1含有蛋白家族保守区,表明该蛋白与COR413蛋白家族具有相似的功能(图5)。利用NetPhos3.1Server对VvCOR413-I1氨基酸序列分析表明,它含有13个Ser、5个Thr、1个Tyr为磷酸化结合位点(图6)。植物受到胁迫时,VvCOR413-I1磷酸化快速直接参与酶的作用机制,并介导蛋白活性,以应对不利的生存条件。


  2.4.2VvCOR413-I1编码的氨基酸序列同源性比对。利用DNAMAN软件对VvCOR413-I1与其他植物的COR413氨基酸序列进行对比(图7)。结果表明,VvCOR413-I1与其他植物的COR413蛋白同源性均为63.00%以上,其中与土瓶草的COR413蛋白的同源性最高,为68.33%。


  2.4.3VvCOR413-I1结构预测与分析。运用DNAMAN和SOPMA软件预测VvCOR413-I1蛋白的二级结构,表明该蛋白约含39.05%的α-螺旋,30.00%的延伸链,8.10%的β-转角,22.86%的无规卷曲(图8)。利用软件TMHMM对


  VvCOR413-I1蛋白的氨基酸序列进行跨膜区的结构分析,结果表明,VvCOR413-I1的氨基酸序列中共有4个跨膜结构区(图9),而且其4个跨膜结构域与其他植物的COR413蛋白高度相似。VvCOR413-I1蛋白的结构域分析表明,其含有植物耐寒蛋白的COR413結构域和该家族的结构域结构,并存在4个跨膜结构与TMHMM分析结构一致(图10)。


  3结论与讨论


  利用RT-PCR的方法成功克隆了VvCOR413-I1全长,其包括630bp完整的开放阅读框,推测编码230个氨基酸。VvCOR413-I1蛋白的分子量(MW)为59.18kD,等电点(pI)值为10.74,含有4个跨膜结构域。多重序列比对表明VvCOR413-I1与其他植物COR413蛋白的氨基酸一致性为63.00%~68.33%。


  随着植物分子生物学技术的快速发展,对植物COR413基因及其应对冷、寒逆境胁迫应答方面研究较多,且对COR413蛋白功能研究及耐寒分子机制探索有了突破性进展。对拟南芥耐寒COR413基因的研究表明,CBF基因表达可以调节COR基因的表达能力,同时COR基因的启动子含有CRT/DRE元件,通过COR413基因自身表达和联动表达模式,提高拟南芥的耐寒性[8]。与此同时,在山葡萄COR413基因家族中已发现4个成员,通过耐寒试验研究表明,COR413基因家族具有提高植物耐寒能力的功能,但不同种间表达量存在差异[9]。笔者对山葡萄北冰红的VvCOR413-I1基因进行克隆,并在分子水平上对其特性进行分析,为研究其功能和利用基因工程手段培育葡萄耐寒品种奠定了基础。


  作者;王学娟