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千层塔繁殖技术研究进展

作者:第一论文网 更新时间:2015年10月30日 10:03:34

千层塔(Huperzia serrata),为石杉科石杉属多年生草本植物蛇足石杉的全草[1],又名金不换、虱子草、宝塔花等。千层塔具有清热解毒、生肌止血、散瘀消肿等功效,民间多用于治跌打损伤、瘀血肿痛、内伤出血,还用于治痈疖肿毒、毒蛇咬伤、烧烫伤等,少量鲜食可防治老年痴呆症。千层塔的有效成分主要有生物碱、三萜类化合物和黄酮类化合物等。1972年我国科技工作者首先报道了从该植物中分离的石杉碱甲具有药理作用,治疗老年痴呆症疗效显著。目前石杉碱甲在美国已经进入三期临床研究,在我国也已获批上市并进入四期临床。由于所含石杉碱甲具有的显著药理作用带来了巨大的市场效益,千层塔天然提取物在世界市场上的交易价格高达50万美元/kg,被誉为“植物的黄金”。

在巨大的经济利益驱使下,野生千层塔被人为大量采掘和破坏,致使该资源处于濒临灭绝的状态。千层塔生长缓慢,而且野生千层塔以孢子繁殖为主,孢子萌发周期长,地下生配子体需6~15年才能成熟[2]。近20多年来,石杉碱甲的合成研究一直是有机合成化学家和药物学家的热点课题,综观目前为止所报道的各种合成方法,均具有一定的局限性,很难以较低成本大量合成高光学活性的石杉碱甲[3]。从植物中提取石杉碱甲,依然是目前最有效的方法,但从植物中提取石杉碱甲由于原料有限,远远满足不了市场需求,因此,研究千层塔的人工繁殖技术,对丰富石杉碱甲的原料来源有重要意义。本文对千层塔的扦插繁殖、芽胞繁殖、组培繁殖等研究进行整理归纳,为千层塔人工繁殖及其有效成分可持续利用提供参考。

1扦插繁殖技术

扦插繁殖是利用植物再生能力,取植株营养器官的一部分插入合适的基质中,使之生根抽枝,成长为新植株的一种快速繁殖方法。扦插繁殖具有能够继承植物原有遗传特性的优点。千层塔枝条扦插能长出新根而成苗,且天然环境繁殖结果优于人工环境[4]。

适当的激素与剂量能诱导千层塔生根并促进生长。冯世鑫等[5]研究发现芸苔素内酯对千层塔插穗生根与成活有促进作用,浓度2mg/kg时作用最强,成活率最高。盛束军等[6]发现采用2000mg/L吲哚丁酸、1000mg/L生根粉处理,千层塔发根时间早,发根率和分叉率高,有利于插条的生长发育,扦插效果好。龙华等[7]发现在原生境中,插条在20mg/L萘乙酸中浸泡5min有助于千层塔生根,且效果显著。

扦插育苗,要选择适应植物生理的基质。优良的生长基质要求基质多孔、通气、排水良好和能保持湿润[8],腐殖土与河沙的混合土壤作扦插基质比两者单独作为基质效果要好[6]。千层塔生长繁殖与内生真菌存在一定的共生关系,原生境土壤含有的多种微生物、内生真菌和根表真菌提高了千层塔生根过程中吲哚-3-乙酸和儿茶酚、绿原酸、阿魏酸等酚类化合物含量,使得原生境土壤上千层塔扦插生根率提高[9]。土壤pH 值对千层塔的生长发育影响很大,在弱酸性土壤中扦插苗能够正常地生长发育和繁殖,但在碱性土壤中多数植株会死亡。

2芽孢繁殖

石杉属植物是一类古老的小型拟蕨类植物,在自然条件下,千层塔的繁殖主要是孢子繁殖、分株繁殖和芽胞繁殖。芽胞是一种变态叶,千层塔芽胞有5个胞片和1个幼芽构成。胞片起保护作用,幼芽萌发长出叶与茎,芽胞基部生根。芽胞也是一种重要的营养繁殖体,与孢子繁殖相对比,数量远不及孢子数量,但萌发速度快,生成的新植株生长快,培养容易。因此,芽孢繁殖是一种快繁方式[10]。

千层塔通常于每年春季在植株分枝的顶部围绕茎产生芽胞,秋季逐步从母株脱离。芽胞产生的时间和数量因生境和植株株龄的差异而有较大的差异。芽胞自母株脱离后在合适的土壤基质中能迅速生长成新植株,其萌发途径有:(1)芽胞在母株芽托上已萌发,长出茎叶,受外力作用后脱离母株,接触基质后萌生新根,长成新植株;(2)芽胞在母株芽托上未萌发,脱离接触基质后发育,同时形成根和幼叶[10]。

光照和湿度是芽胞萌发的关键因素[7]。在光照充足、相对湿度达85%以上的生境中,脱落在土壤表层的芽胞经光刺激约15d后开始萌发。土壤表层下的芽胞随着埋藏深度的增加,萌发率降低。未萌发的芽胞并未死亡而是进入休眠状态,土壤下众多的休眠芽胞形成了“芽胞库”。休眠的芽胞再次移至土壤表层,很快就能萌发。这种“芽胞库”对于维持千层塔种群的稳定以及抗逆性都有重要意义。

在人工培养条件下培养芽胞,Moore培养基中芽胞萌发时间短,生长情况好。培养温度对千层塔芽胞的萌发起着重要作用,芽胞萌发的最适宜温度为22℃,但对后期生长发育无显著影响。芽胞的萌发与生长也适宜在弱光下培养,强光能抑制不定根的生长。赤霉素对芽胞萌发及生长有抑制作用[11]。

3组织培养技术

组织培养是在无菌条件下,用培养基给外植体提供营养与激素,使其再生植株或者获得其他有经济价值的产品的技术,也是一种快速繁殖技术。千层塔自然繁殖能力低,可以采用组织培养技术实现快速繁殖。

3.1外植体消毒

组织培养必须要在严格无菌的条件下进行,培养基若染菌,微生物快速繁殖,与外植体争夺营养,分泌物抑制外植体生长。千层塔植物体内存在数量众多的内生真菌,而外植体壁薄,消毒困难,灭菌成功率低,如何有效消毒是千层塔组织培养成功的关键。

孢子囊、孢子、茎尖等材料几乎不含内生菌,只需要表面消毒处理即可。杨雪飞等[12]用孢子体为材料,用70%乙醇灭菌40s、0.1%升汞溶液灭菌8min、70%双氧水溶液灭菌10min,进行表面灭菌,培养2周,表面无菌率达63%。李贵等[13]用孢子囊和茎尖为材料,经预处理后,再经过70%酒精处理30s、0.1%升汞处理4min,培养2周,污染率极低。

茎段、顶芽等材料含内生菌的材料需要内消毒和表面消毒相结合才能取得好效果。李贵等[13]以茎段为材料,经预处理后,用47℃热水预处理1h,再用70%酒精处理30s、0.1%升汞处理7min,能达到较好的表面消毒及内生菌消除的效果。马英姿等[14]以顶芽做材料,采用0.5mg/L孔雀石绿及100mg/L的混合抗生素(每100mg AAS溶液中包含30mg青霉素、50mg链霉素和125μg两性霉素)混入1/2MS培养基中培养14d,再转入1/2MS初代培养基中进行初代培养,获得较好的外植体内生菌杀灭效果。

3.2外植体培养

用顶芽消毒杀菌得到无菌苗,无菌苗用1/2MS+25g/L蔗糖培养基培养,培养90d后,外植体顶芽形成新二叉分枝。在二叉分枝后的新枝长到4~5cm时剪下进行继代培养,得到丛生芽[15]。顶芽的诱导形成受培养基中蔗糖浓度的影响,当蔗糖浓度为1%时,芽全部白化死亡;提高蔗糖浓度,芽伸长生长,并在基部产生丛生不定芽;蔗糖浓度为2%时,所有转接的新芽均发生丛生不定芽;当蔗糖浓度为2%~4%时,转接的新芽在顶端和基部均出现GGB(绿色球状体)[16,18],GGB的发生率随蔗糖浓度提高而提高,低浓度时以顶端GGB为主,高浓度时以基部GGB为主[19]。GGB分离培养,增殖分化成丛生苗,每丛平均有16 个丛生芽,繁殖系数高。不定芽长长后,切下继代培养,千层塔数量就得到扩增。

组织培养中经常诱导外植体脱分化,形成愈伤组织,愈伤组织诱导再分化,形成不定芽、不定根进而形成完整植株,实现数量扩增。周颖[17]等把茎尖在MS+0.05μmol/L IBA+1.4μmol/L KT+2mg/L谷氨酰的培养基上,培养3个月后,诱导出了愈伤组织,诱导率为12.5%。目前还没有再分化的报道。

3.3外植体生根

千层塔的顶芽、侧芽和不定芽,必须诱导生根后才能下地栽培,形成完整的组织培养快繁体系。马英姿[14]等用千层塔的顶芽与侧芽接种在添加IBA 1.0mg/L+谷氨酰胺2.0mg/L的1/3MS基本培养基上培养生根,侧芽的生根率可达90%,顶芽的生根率也可达30%。新枝外植体可以用不含激素的培养基(1/4MS矿质元素+1/2MS有机元素+2%蔗糖+4.5g/L琼脂,pH5.8)培养,培养4~6月后,有42%外植体从茎下端切口处自然生根[12]。

4展望

在人工合成取得有效突破之前,通过千层塔提取天然石杉碱甲依然是解决药源的主要途径,市场需求量巨大。人工繁殖研究虽然取得了一定的成就,但是距离大规模商业化种植还有许多工作要做。未来可以从以下几个途径入手:(1)选育良种,使用杂交育种、无性系选择育种、诱变育种和分子育种等多种育种手段运用[20],选育生长速度更快、石杉碱甲含量更高的千层塔优良品种,进而为石杉碱甲提取提供原料;(2)建立千层塔组培快繁系统,组培技术越来越多的应用于中草药生产,其具有生长快、周期短、繁殖系数高,可周年生产等优点;建立千层塔组培快繁系统不仅有利于千层塔无性快繁,还将对于千层塔的种质资源保存、新品种开发等具有积极意义。

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